显微成像技术现在发展的越来越成熟，这些先进的技术可以帮助我们在不同样本类型和图像应用中捕获到尽可能多的细节，提供了强大的助力，然而，随着研究越来越复杂，显微数字图像检测系统越来越多样，我们需要对各种显微相机的运作方式有基本了解，以便适配并采纳最佳解决方案以满足成像需求。

因此，了解来自样本的模拟信息是如何被处理成数字图像以供存储和展示这一过程的基本概念对于显微镜操作者来说较为重要。无论是比较要购买的相机，还是确定实验室或核心设施中哪个现有的显微镜最适合研究需求，都必须理解一些基本要素，选配合适的成像系统，来尽可能的获取高质量数据。

图像捕获方法：

光学显微镜的数字成像起点，是感知来自样本不同区域的光子数量（信号强度）并准确识别光子在样本中的起始位置，其感知到的到达相机传感器的信号是模拟格式，而相机必须将该模拟信号转换为尽可能准确表示模拟信息的数字信号。

对于数字成像，有两种方法获取模拟信号强度和位置信息。

第一种是帧图像捕获，其中来自目标视场的光线同时投影到传感器阵列上，阵列中每个传感器捕获来自样本的一小部分信息，这些信息的阵列组合就形成了我们观测视场的中的图像

这种方式下，相机同时捕获了光子信号的强度及其在样本中的位置。（图1）

图1

另一种方法是点扫描图像捕获——将光聚焦到样本的一个小区域并捕获来自该小区域的信号（图2）。

在这种方法中，光束通常在样本上进行光栅扫描以顺序获取所需的视场。在这里，传感器只捕获了传入信号的强度，而其位置信息是从照明光束在样本上的位置推断出来的。

图2

全帧图像捕获：

帧图像捕获系统的案例有不同类型的电荷耦合器件（CCD）和科学互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机。

不管是CCD还是sCMOS相机，来自样本的入射光子击中光传感器，其能量被转换为电子（图2）。

其产生的电子数量与捕获的光子信号强度成正比。然后电子被转换为电压，由模拟数字转换器（ADC）读取并数字化为代表传入信号强度的灰度值。

然而，在超过一定的光子通量（每单位时间的光子强度）后，传感器将无法产生额外的电子。

这个值，就是传感器的满阱容量，超过这个水平，传感器就被认为是饱和的。

为了准确测量信号强度，信号必须保持在满阱容量以下，最理想情况下是将其控制在最小可检测信号和满阱容量之间。

在这种类型的图像捕获中，单个传感器的大小决定了图像中的像素大小（分辨率），传感器大小必须足够小，才能捕获由显微镜形成的图像中最精细的细节。

冷却CCD是使用传感器阵列设计的两种技术中较老的一种。在最简易的CCD阵列实现中，落在每个传感器（像素）上的光被转换为电子。在曝光结束时，存储在传感器中的电子信号被顺序地逐行转移到读出寄存器，然后逐帧放大并转换为数字值（图3）。

图3

这个过程需要时间，从而会减缓相机的帧率。

目前已经开发了几种CCD处理的变体以增加灵敏度。行间冷却CCD（图4）是显微镜中使用最普遍的CCD类型。

图4

#在传统的冷却CCD相机中，由独立的传感器收集的电子被顺序地一行一行地传输到串行读出寄存器中。从读出寄存器，电荷被逐像素读取，放大，并数字化为二进制灰度值存储在计算机存储器中并随后显示。在行间CCD中，电荷首先从单个传感器转移到存储寄存器中，然后从那里逐行读出。这使得传感器可以更快地开始收集另一个图像。

对于CCD，像素电荷会被转移到存储寄存器中进行读取，而不是在开始新的曝光之前逐个像素地读出其值，这样做释放了单个传感器可以去进行新的曝光。虽然这允许更快的周转，但电荷存储区域减少了芯片上可用于光收集的区域。目前大多数行间CCD使用微透镜将入射光聚焦到传感器区域，这在一定程度上缓解了阻挡光的问题。

尽管CCD在显微镜中仍有其用途，但在大多数应用场景下，CCD已被sCMOS系统取代。在CCD阵列中，每个像素的信息通过一个输出节点、放大器和数字转换器传输，而对于sCMOS相机，像素是并行读取的（图5）。

图5

他的每个传感器都包含自己的电容器和放大器，每行像素都有自己的ADC。这以更低需求的功率实现了更快、更高效的读取。

当前sCMOS技术比CCD有许多优势，包括更宽的视场、更高的量子效率（QE）、更宽的动态范围、更快的帧率和更好的功率效率。

另外，CCD和sCMOS的量子效率在所有波长上都不是均匀的。了解相机的光谱响应对于数据解释至关重要，特别是在荧光数据中，必须分离来自密切相关的光的波长的信号。

尽管sCMOS相机相较于CCD有一些优势，但并不能在所有场景下完全取代。

冷却CCD比等效的sCMOS系统具有更少的暗电流噪声，这种噪声会在长时间曝光下累积，因此对于需要长时间曝光的、信号非常低的样本，冷却CCD将具有更好的信噪比阈值。这些类型的样本包括生物发光研究、荧光素酶报告成像和基于化学还原的荧光。

像素大小影响传感器的满阱容量和相关的动态范围。传感器的动态范围计算方式是总满阱容量除以噪声水平。因此一个满阱容量为6000、噪声水平为2e-的传感器,将具有3000:1的动态范围.从黑到白，它可以区分3000个单独的光子通量水平，并将它们转换为图像中的3000个不同的灰度值；一个满阱容量为34000、噪声水平为2e-的传感器将具有17000:1的动态范围，这个相机相对具有更强大的能力，能够清晰识别来自样本不同区域的信号强度的更微妙的差异，使图像具有更高的对比度分辨率。

点扫描图像捕获：

在点扫描图像捕获中，样本被聚焦光束探测，记录光束与样本相互作用的信息。激光扫描荧光共聚焦显微镜是光显微镜中使用的主要点扫描系统。还有其他扫描荧光技术，但这些技术并不广泛采用。

动态范围和模拟数字转换：

动态范围是一个经常被忽视的选择相机的重要参数——相机系统还必须将原始动态范围转换为数字值，因此，必须了解相机的ADC能力。

大多数现代相机允许在数据收集期间选择图像的位深度，这是一个非常有用的特性。例如，12位图像可以显示从黑色到白色的全灰度作为4,096（212）个不同的灰度色调，而16位图像可以存储和显示65,536（216）不同的灰度色调。

然而，16位图像相对文件大小更大，而且读取速度更慢，如果需要高速成像，应选择较低的位深度。相反，如果目标是最大化对比度分辨率，特别是对于定量分析，应使用更高的位深度。

除了位深度，还必须考虑相机传感器能力。如果相机的动态范围仅为4000:1，那么在超过12位（4,096灰度值）的对象进行数字化纯粹是浪费时间和计算机内存的。

荧光显微镜的相机要求：

荧光通常比明场的信号更弱，并且由于光毒性和光漂白，它并不适合长曝光时间。因此，选择一个具有高灵敏度和低噪声的相机进行荧光显微镜检查是很重要的。

具有低读取噪声和低暗电流噪声的相机是荧光显微镜的理想选择。由于每次捕获图像时都会发生读取噪声，读取噪声越低，可以在不降低图像质量的情况下使用的增益就越高。这允许更短的曝光时间，这有助于限制暗电流噪声。暗电流噪声与温度和时间有关，通常以给定温度下的每秒电子数表示。在弱信号的情况下，即使是最好的相机，动态范围也会缩小。因此确定在典型数据采集条件下产生的动态范围，将有助于确定在哪个位水平下执行模数转换。

幸运的是，荧光图像通常固有地具有较小的动态范围，较低的动态范围通常不会对图像产生不利影响。

事实上，尽管了解了显微相机的运作模式和评估的关键参数，让我们直接比较相机的数据并得出确切的结论并非易事，因此仍然推荐查看相机的参数后，在实际条件下去进行相机试用测试，来确保能够得出最佳的效果。

【文章来自MicroscopyEducation

Choosing the Best Camera System for Your Biological Light Microscopy Needs: Part II  W. Gray (Jay) Jerome

Pathology, Microbiology and Immunology, Vanderbilt University, Nashville, TN  jay.jerome@vumc.org】

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