荧光成像为生命科学研究带来了无限可能，从宽场荧光到共聚焦，再到超分辨，我们观察的精度不断提升，但一个问题始终存在——荧光淬灭。今天我们来看看《自然》杂志的工具论文，“走向更亮更耐光的荧光团”，了解下更耐光的荧光团是怎么炼成的。
一、荧光淬灭是什么？
先定义下荧光淬灭。荧光淬灭或者通俗点叫“褪色”，泛指降低荧光团荧光强度的所有过程。
①大致可以分为四种：
1、化合物形成complex formation
化合物形成淬灭
荧光物质分子与外部分子/离子反应形成非荧光化合物，常见的荧光淬灭就是高光强下氧化形成新的化合物，这种现象也叫光漂白photo bleaching，是不可逆的破坏。
2、能量转移energy transfer
FRET：蓝荧光转移成黄荧光
顾名思义，能量出现了从供体到受体的转移，如果受体不产生荧光，那荧光就熄灭了；如果受体产生荧光，就会出现受体荧光和次级荧光光谱红移，这就是荧光共振能量转移FRET.
3、激发态反应excited state reactions
ESIPT激发态分子内质子转移②
激发态高能量下荧光团化学结构出现结构破坏，改变荧光特性，这种现象称为激发态分子内质子转移ESIPT，可以理解为2的质子转移版本。
4、浓度淬灭collisional quenching
聚集诱导淬灭ACQ和聚集诱导荧光AIE③
荧光分子聚集或距离过近导致互相干扰，非辐射衰减概率增大，使发光效率下降，这种现象称为聚集诱导淬灭ACQ。有些荧光团反过来，是在聚集态才会增强荧光，这种现象就是聚集诱导荧光发光AIE.
二、三种改造荧光团的尝试④
荧光发光原理⑤
荧光团在激发态回到正常态需要释放能量，要么发出荧光释放，要么以震动等形式非辐射衰减释放。理论上，减少非辐射衰减的比例，就能提升荧光释放比例，以此获得更高光强、更长的荧光寿命。
1、加固蛋白结构的mCherry
mCherry的结构渲染图，外层螺旋是β-桶结构
通过改变荧光蛋白的蛋白支架结构，使其更稳定，从而提升荧光强度，延长荧光寿命，比如“加固”mCherry的β-桶结构，防止发色团的分子重排，可以减少非辐射衰减，得到的mCherry-XL 和 mScarlet3 都比mCherry更亮更耐光。
mScarlet3亮度是mCherry 5倍左右，寿命3倍以上
2、关闭非辐射衰减的EGFP
EGFP标记的斑马鱼，MZX81拍摄
通过模拟计算，科学家发现EGFP存在的一个非辐射途径是电子从发色团转移到酪氨酸残基上，从而改变了荧光特性。把酪氨酸换成亮氨酸，可以阻断这个非辐射途径，成功将EGFP的耐光性提升80倍。可惜这种EGFP的亮度受到了负面影响，变暗了，因此在生物领域可能用不上。
3、改良工艺的罗丹明系列染料
Janelia Fluor对比传统染料
罗丹明是Texas Red、ROX、TAMRA等染料的基础成分，传统合成工艺在试剂环境、精度控制等方面存在局限，有科学家成功以更现代化的合成工艺对其进行改良，在烷基氨基取代基中引入氘原子，改变了关键分子尺寸，从而减少了非辐射衰减。这形成的就是Janelia Fluor系列荧光染料，覆盖从绿色到红色荧光光谱，可以提供几倍于传统荧光染料的荧光光强和荧光寿命。
三、如何更好地使用这些改良的荧光团？
mCherry-XL激发峰在Y波段
荧光团改良后，不仅荧光强度更高、荧光寿命更长，其激发发射属性也可能发生变化。比如mCherry-XL和mScarlet3，它们需要使用Y通道激发，而不是原版mCherry的R通道激发。
MF43-N可升级Y激发块支持mCherry-XL和mScarlet3
MF43-N和MF53-N可以通过安装Y激发块/G2激发块支持mCherry-XL和mScarlet3，而其他显微镜可以选择带Y通道的数显荧光模块实现支持。
更亮更耐光的荧光团更适合dSTORM超分辨成像
但这些更亮更耐光的荧光团更大价值在于适用于更高要求的成像，比如共聚焦和超分辨荧光成像。使用MF53-TIRF升级成dSTORM成像时，需要搭配高亮度、高耐光的荧光染料，才能获得更高信噪比的成像。而在一些神经学实验中，已经有科学家利用这些新型染料，实现了对脑神经毫秒级的电信号变化进行荧光标记成像，从而更深入揭示神经元信息处理和学习的机制。
①Lakowicz, J.R. (1983). Quenching of Fluorescence. In: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Springer, Boston, MA. https://doi.org/10.1007/978-1-4615-7658-7_9
②Pivovarenko, Vasyl. (2023). Multi-Parametric Sensing by Multi-Channel Molecular Fluorescent Probes Based on Excited State Intramolecular Proton Transfer and Charge Transfer Processes. BBA Advances. 3. 100094. 10.1016/j.bbadva.2023.100094.
③Dongdong Li, Yuping Zhang, Zhiying Fan, Jie Chen and Jihong Yu, Coupling of chromophores with exactly opposite luminescence behaviours in mesostructured organosilicas for high-efficiency multicolour emission,DOI: 10.1039/C5SC02044A (Edge Article) Chem. Sci., 2015, 6, 6097-6101
④Ariana Remmel .TOWARDS BRIGHTER AND MORE PHOTOSTABLE FLUOROPHORES. Nature, 630, 258-260 (2024), doi: https://doi.org/10.1038/d41586-024-01591-7
⑤李迎春，分子发光分析荧光磷光，石河子大学药学院.
⑥Pascal Poc ORCID logoa,et al,Interrogating surface versus intracellular transmembrane receptor populations using cell-impermeable SNAP-tag substrates, DOI: 10.1039/D0SC02794D (Edge Article) Chem. Sci., 2020, 11, 7871-7883
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