光学显微镜观察方式大盘点：霍夫曼调制相衬

霍夫曼调制相衬(Hoffman Modulation Contrast，简称HMC)是ROBERT HOFFMAN教授于1975年提出的一种观察方式①，是基于斜照明技术加入偏振镜、狭缝光阑和调制器改进而来的一种透明样品观察技术，特点是有三维立体感，且适用于塑料培养皿，有人称之为“穷人的DIC”，主要用于IVF注射等显微操作。

MF53-HMC拍摄的卵母细胞

一、成像原理

斜照明成像与明场成像对比②

斜照明（Oblique Illumination）技术又称离轴照明（Off-Axis Illumination），是一种非常古老的显微镜技术，1866年由德国物理学家August Toepler提出③，并由阿贝聚光镜的发明者Ernst Abbe完善，基本思路是利用偏轴光照射样品，然后经过透明样品发生衍射、反射和折射，最终除了未衍射的0级光，还能把一两个临近级别的衍射光（1级和-1级）用到成像中，从而提升分辨率和焦深，形成浮雕样式的立体成像，因此这种观察方式又称浮雕相衬（Relief Contrast，简称RC）。

标准PH相衬和CK40的RPC斜照明相衬，注意斜照明下整个画面明暗渐变

斜照明提升分辨率和焦深的原理

斜照明很多地方跟简易透射暗场相近，只是它的光阑不是环形的，而是半圆或其他狭缝形状，有更强方向性。题外话一句，极紫外光刻EUV也使用了斜照明技术。

霍夫曼光路结构

霍夫曼调制相衬在斜照明基础上加入了三个部件，偏振镜，狭缝聚光镜和物镜调制器，使部分衍射光的强度大于背景光，部分衍射光的强度小于背景光，这样就形成更高对比度的立体成像。

当前霍夫曼调制相衬的专利已经过了保护期，四大品牌都推出了自己的HMC技术，奥林巴斯Evident叫浮雕相衬RC（Relief Contrast，继承以前RPC的命名），尼康叫高级调制相衬NAMC（Nikon Advanced Modulation Contrast），蔡司叫改进型调制相衬iHMC（Improved Hoffman Modulation Contrast），徕卡叫整合调制相衬IMC（Integrated Modulation Contrast），除了徕卡的是特有的机身调制器取代物镜调制器，其他跟原始设计差距不大。

二、关键部件

典型霍夫曼相衬需要三个部件，偏振镜，霍夫曼聚光镜（带狭缝光阑），霍夫曼物镜（带物镜调制器）。

MF53-HMC的霍夫曼相衬配件

·光源偏振镜

光源偏振镜在光源和聚光镜之间

偏振镜在光源和聚光镜之间，相当于一个起偏器，它可以旋转，旋转后可以调整成像的立体感和对比度。

·霍夫曼聚光镜

霍夫曼聚光镜，注意半透明的狭缝检偏器

霍夫曼聚光镜又称狭缝聚光镜，一般采用转盘式设计，按照10X/20X/40X三个倍数有不同的狭缝光阑装在聚光镜前焦面，另有留空孔用于明场观察。

聚光镜狭缝光阑分为三个部分：占大部分的暗区，不透光；离轴的狭缝，100%透光；狭缝检偏器，连着狭缝，尺寸跟狭缝相近，旋转光源偏振镜会改变这个区域的通光率，可以改变成像立体感和对比度。

注意：由于样品在起偏检偏的光路之后，而不是在起偏检偏之间，因此霍夫曼可以看塑料培养皿和塑料样品。

简化版的霍夫曼没有偏振镜，狭缝光阑只有暗区和狭缝，没有狭缝检偏器。

·霍夫曼物镜

霍夫曼物镜会有HMC、PMC、NAMC等标记

霍夫曼物镜跟相衬物镜相似，在物镜后端的后焦平面上嵌入了精密的物镜调制器，这个调制器不能移动不能取出。

霍夫曼物镜后端可见三个区域

物镜调制器分成三个区域：在边缘的暗区，透射1%光线；狭窄的灰区，透射10-15%光线；透明区，连着灰区，100%透光。

霍夫曼物镜能用于明场、暗场和荧光观察，但用在荧光观察时效果不佳，因为有调制器，其透光率低于普通明场物镜。

注意：霍夫曼的狭缝光阑和物镜调制器有很强的方向匹配关系，物镜拧紧后，需要调整聚光镜狭缝方向来匹配，非专业人士请不要调霍夫曼物镜或聚光镜，否则很难调节回最佳状态。

IMC可调的狭缝插板，统一的物镜调制器（IMC/BF文字和孔位相对而非相邻）

另外整合调制相衬IMC的物镜调制器设置在了物镜后焦面的共轭面上，也就是在机身内置而非物镜内置，因此可以使用霍夫曼物镜以外的物镜。但必须提醒的是，IMC是组合消色差设计，物镜与观察头是成套搭配实现消色差的，随便换物镜可能破坏消色差设计导致效果不佳。

三、成像特点

霍夫曼调制相衬成像接近DIC微分干涉，并且在使用层面上还有成本更低、工作空间大、可以观察塑料培养皿等优势，因此广泛应用于显微操作、IVF辅助生殖等领域。

霍夫曼可观察塑料等各向同性材料，DIC不能④

1、强立体感

霍夫曼可以提高透明样品的可见性和对比度，图像有强立体感，效果接近DIC，有利于显微操作。

霍夫曼拍摄的口腔上皮细胞

2、丰富细节，无光晕

霍夫曼没有泽尼克相衬的光晕瑕疵，成像边缘更清晰，且焦深更大，细节丰富。

样品形状和方向不同影响了霍夫曼成像画质

3、强方向性，低可重复性

这是个缺点，霍夫曼观察的效果与狭缝方向、样品方向相关。举例而言，两台霍夫曼显微镜，物镜拧紧之后的旋转角度可能不一致，对应聚光镜狭缝的角度也会不一致，即便样品在两台显微镜之间平移，得出的成像也会有不同，相同原理，同一台霍夫曼显微镜，样品旋转角度不同，即便相同区域成像也会不同。这导致霍夫曼等所有基于斜照明的系统都存在可重复性问题，因此论文普遍倾向用更高可重复性的相衬和DIC等观察方式。

四、主要应用

霍夫曼显微注射

1、IVF辅助生育

霍夫曼的强立体感和大工作空间，让它非常适合精密的显微操作使用，比如在IVF辅助生育领域，霍夫曼可以为卵胞质内单精子注射（ICSI）技术提供成像支持。

2、转基因研究

类似IVF中的精子注射，在各种转基因研究中也有类似的原核注射（pronucleus injection）技术，使用霍夫曼可以为显微操作提供精确的立体成像支持。

五、明美产品推荐

1、显微操作成像平台：MF53-HMC/MIX60-HMC

• 成像具有类似DIC的强立体感，适合卵母等透明样品

• 成本比DIC更有优势，适合IVF等规模化使用

• 带偏光镜，可调节成像立体感和对比度

• 可以满足较厚透明样品观察

①HOFFMAN, R., GROSS, L. The modulation contrast microscope. Nature 254, 586–588 (1975). https://doi.org/10.1038/254586a0

②Pelc, Radek & Hostounský, Zdeněk & Otaki, Tatsuro & Katoh, Kaoru. (2020). Conventional, Apodized, and Relief Phase-Contrast Microscopy. 10.1007/978-1-0716-0428-1_10. 

③To¨pler A (1866) Ueber die Methode derSchlierenbeobachtung als mikroskopischesHu¨lfsmittel, nebst Bemerkungen zur Theorieder schiefen Beleuchtung. (Poggendorff ’s)Annalen der Physik und Chemie (Leipzig)127(4):556–580. https://doi.org/10.1002/andp.18662030405 [Annalen der Physik (Ber-lin) 203(4):556–580]

④Hoffman, R. (1989). Modulation Contrast and Differential Interference Contrast Techniques. In: Hemsley, D.A. (eds) Applied Polymer Light Microscopy. Springer, Dordrecht. https://doi.org/10.1007/978-94-011-7474-9_5

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