如何提升CY5/CY5.5荧光成像效果之滤光片篇

一、cy5/5.5光谱特征图

花氰染料cy5/cy5.5常用于生物分子标记，在荧光显微成像、流式细胞仪分析、小动物活体标记成像中均有广泛使用。Cy5最大激发波长一般在649nm，最大发射波长一般在670nm；cy5.5最大激发波长一般在673nm，最大发射波长一般在695nm。其激发特征在近红外（红外）谱段，且激发和发射波长半高宽（特征谱线中峰值一半对应的波长宽度）较窄，对滤光片组的选择要求较高，否则荧光信号较弱或无法捕获荧光信号。

左cy5光谱特征图，右cy5.5光谱特征图

二、Cy5/cy5.5荧光成像中的滤光片选择

荧光成像基于斯托克斯位移原理，其基本表现为荧光物质经过特定波长的光激发，发射出较长波长的光。其激发和发射过程对应到荧光显微成像系统中的两个关键部件分别是荧光光源和荧光激发块，Cy5/cy5.5的荧光成像原理也是如此，只是其激发和发射特征偏向于近红外（红外），对于滤光片的选择需更加注意。

Stokes位移，能级跃迁产生荧光信号

发射光谱比激发光谱波长更长

cy5/cy5.5荧光成像的核心部件：荧光激发块。由三片滤光片组成：激发滤光片、二向分光镜、发射滤光片。激发滤光片允许特定波长的光通过；二向分光镜反射短波长的光，透过长波长的光；发射滤光片，只透过所要观察波长的光，把不需要的波长的光去除。

激发块示意图，由三组滤光片组成

荧光滤光片主要有三种，LP长通滤光片，限定波长长于指定值的光可以通过；SP短通滤光片，限定波长短于指定值的光可以通过；BP带通滤光片，可以让中心波长附近一定波长的光通过，当这个范围比较窄的时候，我们还会给这种带通滤光片“窄带滤光片”的称呼。

滤光片的三种类型：长通（LP）、短通（SP）、带通（BP）

使用带通滤光片可以获得相对更高信噪比的荧光成像，而不同参数的带通滤光片，会对成像效果有重大影响，比如下图A和B两组带通滤光片，A组滤光片是窄带，搭配比B组能多检测出90%的有用信号，减少200%的背景干扰信号，在图像上表现为A组信号更清晰透亮。此外，由于技术水平问题，国内窄带滤光片的截止深度（OD）要比进口差，光谱表现为光通效率到边缘“缓坡下降”而不是“断崖下降”，最终成像效果不如进口窄带，单要稍优于普通带通。

窄带滤光片成像更高信噪比

荧光信号的获取在于激发光和发射光的选择，激发滤光片需匹配光源中心波段与染料激发谱段，发射滤光片需覆盖染料发射谱段峰值。以下是cy5、cy5.5两个典型chroma公司滤光片组光谱图。

Chroma CY5滤光片组EX:620/60，DM:660，EM:700/75

Chroma CY5.5滤光片组EX:650/45，DM:685，EM:720/60

三、明美滤光片选择

滤光片的选择应根据实际的应用、成本来综合考量，进口大截止深度、小窄带宽度的滤光片有更好的效果，但成本也是显著更高的，某些仅能适用cy5/cy5.5几种染料，某些适用范围更广，所对应的效果和成本也会有所变化，同时有的还考虑到与现有的光源、显微镜适配，选择也会存在差异化。针对cy5/cy5.5等荧光染料，明美可提供国内和国外不同厂家不同品质型号的滤光片组，适用于奥林巴斯BX2或BX3系列、尼康Te/Ti系列、尼康50i/80i/90i、徕卡DM2500/3000/4000/5000/6000、蔡司Axio Imager等四大品牌多种信号，保证您的实验效果，欢迎来电咨询！

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