光学显微镜观察方式大盘点：暗场
暗场观察（Dark field）是和明场观察（Bright field）对应的一种观察方式，其基本思路是屏蔽直射光，然后用散射光进行观察，实现类似丁达尔效应的效果，揭示明场下无法观察到的细节。星空可以说一种暗场观察，星星一直都在，但在白天有太阳（直射光）的时候看不到，在晚上，不再有太阳直射光，星星的散射光在黑暗的背景下变得可见。
ML31暗场拍摄的木槿花粉
一、成像原理
透射暗场光路
暗场成像原理简单，挡住直射光，只让倾斜光照明样品，样品产生散射光，然后散射光通过物镜成像。相比透射明场光路，透射暗场只是在光源到聚光镜镜片之间加入了暗场光阑，来挡住光源中间的直射光，形成倾斜光照明样品。
简易暗场聚光镜产生倒置空心圆锥体照明
稍微复杂点说，暗场聚光镜会产生倒置空心圆锥体照明，并将焦点集中在样品平面上，在没有样品且聚光镜N.A大于物镜N.A的地方，倾斜光会相互交叉并错开物镜，形成暗背景；而经过样品的倾斜光会产生衍射、反射/折射，形成明亮的样品图像。
反射（落射）暗场光路
反射暗场光路原理跟透射暗场光路一致，只是结构有些变化，除了多了个环形反射镜产生反射照明，其物镜前端也有特殊的反射结构来反射聚光，这种物镜就是BD明暗场物镜。
暗场是一种很好的观察方式，特别适合呈现样品轮廓、边缘、边界和折射率梯度，暗场成像的分辨率可以超出物镜数值孔径计算的分辨率，完美状态下暗场甚至能呈现直径20-40纳米的鞭毛之类细节，但实际上比较难实现。
二、关键部件
暗场观察有简易的，有专业。简易的透射暗场非常简单，加个暗场环（暗场光阑）即可。
专业的高倍暗场需要油浸式暗场聚光镜、带孔径光阑的高倍物镜；专业的金相暗场需要暗场反射模块、明暗场物镜。
·简易透射暗场（40X以下）
ML31简易暗场聚光镜（阿贝聚光镜+暗场环）
简易暗场观察只需在阿贝聚光镜基础上加入暗场环即可实现，这个暗场环通常安装于聚光镜底部，用推拉插板或者32mm滤光片托架安装都可以，一般简易暗场到N.A0.6效果都还行。也就是说最高搭配Plan 40X或者Plan Fluo 20X物镜，更高N.A的物镜可能需要在聚光镜和玻片底部之间滴油来提升照明N.A.
用3D打印实现的暗场环插板和暗场环
暗场环核心是遮挡直射光的圆形挡板，周边镂空通光。在简易暗场聚光镜中，不同倍数物镜匹配不同直径的挡板，虽然高倍物镜用大直径挡板的暗场环也能观察，但效果不佳，因为暗场观察中要求聚光镜照明N.A高于物镜N.A，而暗场环遮挡越大，照明N.A越低，可能出现照明N.A太低而效果很差。
·专业透射暗场（20X-100X）
专业暗场聚光镜
专业的暗场聚光镜有很多种，特点是特殊结构，带来特别高的N.A.以UIS系统的U-DCW油浸式暗场聚光镜为例，其照明N.A可以到1.2-1.4，可以使用20X以上，N.A1.2以下的高倍物镜。这种聚光镜使用比较费工夫，需要对中，并且滴油时不能有气泡，否则暗场效果不佳。
暗场用的高倍物镜
原则上，透射的暗场观察无需特别的暗场物镜，直接用普通物镜即可。例外情况是100X物镜，由于100X物镜的N.A起码都有1.25，而暗场照明要求照明N.A显著大于物镜N.A，因此连上述的U-DCW油浸式暗场聚光镜都带不动一个普通Plan 100X. 为了满足暗场使用，部分100X物镜会加入可变光阑，用来降低物镜N.A，以匹配暗场聚光镜N.A.
·专业反射暗场（金相）
暗场反射模块（从物镜端看）
在金相显微镜中，明场和暗场观察切换是通过切换反射模块实现的，以金相显微镜MJ43为例，明场反射模块主要是一片45°的半透半反镜片，而暗场反射模块则是在此基础上整合了暗场光阑、45°环形反光镜和一些减少杂散光的光阑，具体不同品牌的暗场反射模块结构会有不同。
金相显微镜的明暗场物镜
反射暗场必须搭配金相明暗场物镜。金相明暗场物镜要比普通物镜粗很多，因为在金相反射暗场中，暗场照明光线并不通过物镜聚焦到样品上，物镜主体以外要留出一圈空间给暗场照明的光通过，另外物镜前端可以看到外壳是明显向前端延申的，以让暗场照明光倾斜反射到样品上，在到达前端反射前，会有一圈环形的透镜或棱镜对光线进行调整。
三、成像特点
ML31暗场下的跳蚤：暗背景，丰富细节
透射暗场成像主要有三个特点：
1、暗背景亮样品。暗场成像最明显特点是暗背景、亮样品，背景暗的程度与照明N.A和物镜N.A的搭配情况相关，通常低于荧光成像或正交偏光成像。样品会明显比背景亮，且呈现完整、细节丰富。
2、颜色真实艳丽。暗场成像能真实反映样品的色彩，同时因为背景暗样品亮，会形成很好的对比度，让样品颜色比明场更真实艳丽。
3、瑕疵可见。暗场成像不仅能突出样品细节，还能突出玻片灰尘、光路灰尘等瑕疵，在离焦面上形成大小不一的光斑，有时可能影响细节呈现，因此清洁光路和样品对保障暗场成像质量很重要。
MJ33下PCB明暗场对比成像
反射暗场成像特点与透射不太一样，主要特点是：
1、暗平面亮凹凸。样品平面部分的光线不会到达物镜，因此会呈现为暗背景，而凹凸不平的地方则会形成散射，到达物镜，比如气孔、凸起、划痕、灰尘等都会呈现出来。
四、主要应用
1、生物学领域
暗场观察和荧光观察检查螺旋体①
用暗场显微镜检测梅毒螺旋体、钩端螺旋体等螺旋体是推荐的方法，因为仪器成本比相衬显微镜低，且在比较低倍观察下就可以发现未经染色的螺旋体的存在。
暗场（C）观察单衣藻和口腔上皮细胞（D）②
暗场显微镜还可以用来观察微生物运动和细节，比如在明场下单衣藻很难看出鞭毛等一些细节，而使用暗场观察可以清晰看到鞭毛以及部分内部细节。使用暗场观察口腔上皮细胞，也可以看到细胞核等细节。
暗场下的硅藻
暗场显微镜还适合用于观察一些微小生物，如水生生物、硅藻、小昆虫、未染色的细菌、酵母、组织培养细胞和原生动物，此外骨、纤维、头发也是暗场观察的理想目标。
2、金相领域（材料学、工业等）
MJ43明暗场对比检查芯片焊点
在金相领域，暗场观察通常搭配明场观察使用，来呈现明场观察下无法发现的气孔、凸起、划痕、灰尘等瑕疵，比如检查芯片焊点等芯片检查工作。
MJ33暗场拍摄测量薄膜厚度
在一些孔隙率差异或折射率梯度的聚合物和陶瓷薄片，比如薄膜、光纤中，使用明场观察会有边缘模糊的问题，导致尺寸测量存在不准确的问题，使用暗场观察可以更准确呈现边缘，使尺寸测量更加准确。
五、明美产品推荐
1、生命科学推荐产品：生物显微镜ML31暗场配置
简易透射暗场观察，可快速切换明场暗场
10X/22大视野目镜，更高工作效率
满足40X-400X暗场观察需要
适用于疾控螺旋体观察、藻类等微小生物观察
2、芯片质检和金相分析推荐产品：研究级金相显微镜MJ43-BD
研究级机身，支持明场、暗场、偏光观察方式
可选半复消色差或复消色差BD明暗场物镜
可扩展荧光观察等其他观察方式
适用于材料芯片、硅片、金相样品等观察和质检
3、金相分析推荐产品：倒置金相显微镜MJ42BD
倒置金相显微镜，工作空间更大
长工作距离平场消色差BD明暗场物镜
支持明场、暗场、偏光观察方式
适用于金相组织、矿物样品的观察
4、大样品检查和测量推荐产品：金相显微镜MJ31BD大台面
超大载物台，适合PCB等大尺寸样品
可选消色差或半复消色差BD明暗场物镜
支持明场、暗场、偏光观察方式
适用于大片PCB等大尺寸样品的观察
①METHODS article,Front. Cell. Infect. Microbiol., 20 August 2019,Sec. Molecular Bacterial Pathogenesis,Volume 9 - 2019 | https://doi.org/10.3389/fcimb.2019.00287
②Charlotte K. Omoto，华盛顿州立大学，使用CH2教学显微镜拍摄
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