细胞生物学应该用什么显微镜？

发布时间：2022-08-04

一、细胞生物学概念

细胞生物学是以细胞为研究对象，从细胞的显微水平、亚显微水平和分子水平三个层次，研究细胞结构、功能和生活史。显微结构一般是指大概轮廓，大的结构，如线粒体，叶绿体，细胞核等，其分辨力大于0.2微米，可在光学显微镜下观察；亚显微结构是更具体的结构，如细胞膜，核膜，内质网膜等，其分辨力小于0.2微米，受制于光学显微镜的衍射峰值，需用电子显微镜才能够分辨，但电子显微镜不适用于活细胞成像，很多应用研究也只需确定该亚显微物质的分布而无需明确具体结构，因此通常可通过荧光标记等方式使用宽场荧光显微镜或共聚焦显微镜等进行研究。

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明美显微镜相机MC50-S下的细胞成像

二、显微成像技术在细胞生物学中的应用

细胞生物学主要对细胞的生命活动进行研究，包括生长、发育、繁殖、遗传、变异、衰老、死亡、代谢、调控、分化等，使用光学显微镜可以进行的研究内容有以下几种：①生物膜与细胞器；②细胞信号转导；③细胞骨架体系；④细胞核、染色体及基因表达；⑤细胞增殖及其调控；⑥细胞分化及干细胞；⑦细胞死亡；⑧细胞衰老；⑨细胞工程。

这些研究都基于对细胞显微水平及亚显微水平的观测：

（1）研究细胞显微层面的形态、活动，如细胞迁移、胞吞、细胞的纤毛和鞭毛运动等

细胞一般呈透明状，未经染色的标本或活细胞，适用于相差观察，如活细胞培养（划痕实验、迁移实验）

（2）细胞亚显微水平的染色及荧光标记观测

细胞亚显微结构大小一般小于0.2微米，使用光学显微镜无法观测其具体结构，但可利用其结构中的蛋白质或核酸等物质，选择合适的荧光染料与其结合，通过荧光显微镜观测荧光信号从而判断该物质的分布和活动。

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MF53-N下的细胞有丝分裂

三、显微成像技术在细胞生物学应用中的挑战

细胞生物学成像有以下几个难点需要注意：

Ø 细胞的长时间活性和健康度需要培养条件支持。细胞的活性和健康度需要合适的温度、湿度和气体培养条件支持，离开了这些条件细胞无法长时间保持活性。如果观察和实验可以短时间完成，那么离开培养条件后尽快完成观察和实验即可。对于需要长时间观察的细胞活动，则需要考虑把成像设备放到培养箱里，或者把培养皿放到成像设备上然后使用微流控细胞芯片分析仪等调节、保持培养条件。

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（MF53-N+MSX2拍摄的细胞划痕实验状态）

Ø 不合适的光源可能损伤细胞活性和健康度。高能量的激发光（如汞灯的紫外线）、高强度的光照（如共聚焦的激光光源）、长时间照射，会影响细胞的活率和健康度，这在传统汞灯光源中比较明显。使用LED冷光源的宽场荧光显微镜，做无需染色的相衬或者霍夫曼调制相衬观察，是光源性损伤更低的方案，需要荧光染色时使用低光毒性的的长波段荧光染料（如cy5、cy5.5、cy7等），搭配尽可能低的光强和尽可能短的激发/成像时间，也是一种思路。

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低光毒性的LED光源相衬观察

Ø 荧光染料可能损伤细胞健康。荧光染料的毒性和激发光的光毒性会使细胞健康处于不良的状态，典型的是DAPI和Hoechst，这些染料有一定的毒性，并且使用有光毒性的紫外光激发，对于这种情况，建议在染色后尽快实验，并尽量缩短实验时间。

Ø 不合适的荧光染料搭配会导致成像不理想。荧光染料不合适或过多，会导致光谱重叠、非特异性染色，背景信号会增强，影响荧光成像效果。为了避免这种问题，需要合理选择染料的种类和数量，尽量错开发射波段，并针对染料选择合适的滤光片，通常使用窄带发射滤光片会有更好的效果。另外还可通过加入适量背景试剂减少背景荧光。

Ø 荧光成像考验相机的灵敏度。荧光成像属于弱光成像，普通显微镜相机可能会出现成像时间长、背景噪声高的问题，拍摄的图片容易糊掉。使用高灵敏度的相机，可以降低成像时间，减少光毒性影响，并减少背景噪声，这对于紫外成像和红外成像来说更加明显。对于650nm以上的红外波段成像，还需要用到去除了蓝玻璃/IRCF的sCMOS科研级相机（黑白）。

Ø 焦面漂移，观察目标可能会在实验过程中因移动而失焦。具有自动聚焦功能的活细胞成像仪，可以帮助您保持更长的目标聚焦时间并减少焦点漂移。另外，将细胞培养在恒定温度并保持容器中溶液的体积恒定也有助于解决聚焦漂移问题

四、明美推荐方案

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