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体视镜落射荧光照明图解
发布时间:2020-05-27
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    最近,研究者已经可以在配有高数值孔径物镜的显微镜上搭配荧光观察方法。随着生物特异性的荧光蛋白(如绿色荧光蛋白,GFP)的出现,荧光观察也开始出现在体视镜上。

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    由于体视镜的视野及工作距离大,通过体视镜荧光照明,研究者可以分辨出表达荧光蛋白的生物,如线虫,斑马鱼,卵母细胞,成熟的昆虫等。同时,研究者们可使用镊子、滴管或其他显微操作设备来处理样品。另外,在体视镜下,体视荧光照明更利于样品的观察记录。

    体视镜的荧光照明器与复合式显微上的相同。荧光照明器中有氙灯或汞灯作为光源,外罩一个灯室,灯室通过垂直照明器与显微镜机身相连。如Figure1,2,垂直照明器位于机身的变倍体与观察筒之间。

    下面我们以Nikon SMZ1500体视镜为例,介绍下体视荧光的光路。

    由光源发出的光经过汇聚透镜到达滤色块组中的激发光滤光片,在这里,光源中的光只有一部分(某段特定的波长)能够通过滤片。透过滤片的光被半透半反镜反射,经过机身下部的变倍体透镜组,物镜,到达样品。半透半反镜的具有反射小于特定波长的光,而使大于特定波长的光透过的特性。

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    透过物镜的光已倒锥形照射到样品上,激发与之相应的荧光物质。发射出的荧光透过物镜,中间变倍体,到达发射光滤光片;在这里,又会有一部分光被滤掉,只有被激发出的荧光会通过发射光滤光片。Figure1,2 中显示的为光路构想图。左侧的光路中,发射出的荧光直透过达发射光滤光片,然后进入相机或目镜观察筒;右侧的光路中的发射光要先透过过半透半反镜,再透过发射光滤光片,进入目镜观察筒。

       Figure2,3为荧光滤色块组示意图。每个滤色块组有一个半透半反镜,一个激发光滤光片,两个发射光滤光片。如前面介绍的,由光源发出的光透过激发光滤光片进入滤色块组,被半透半反镜反射;发射出的荧光透过发射光滤光片进入目镜或相机。在这一组合中,半透半反镜以及左侧的发射光滤光片是固定在架子上的,而右侧的发射光滤光片则安装在一个可以拆卸的滤片框内。只要松动螺丝,就可以拆下右侧的滤片框,然后根据需要,更换半透半反镜。更换时需要注意,不要把固定用的胶水,涂到半透半反镜上,操作要带手套,避免将指纹留在镜面上。

    上述体视镜可搭配3各荧光滤色块,以及一个用于明场观察的无滤片块。观察时,可通过拉动杠杆调节滤色块的位置,每一个滤色块配有不同的标识,便于选择。

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       Table1中为Nikon提供的多种滤色片组合。这些滤色片涵盖了荧光激发/发射的大部分波长范围(激发波段380nm-510nm的染料都适用),适用于生物学研究及工业研究。同时,下列组合也适用于绿色荧光蛋白变种的研究,如cyan及蓝色荧光蛋白。在活细胞观察中,选择适当的滤色片组合会提高信号的强度。另外,考虑到叶绿素的自发荧光,当选择为植物观察特别设计的滤片组。

    体视镜荧光滤片组合:

滤片组

激发光波段

半透半反镜

发射光波段

Blue GFP/DAPI

379-401 nm

420 nm (DCLP)

435-485 nm

Cyan (EGFP) GFP

426-446 nm

455 (DCLP)

460-500 nm

Endow GFP 带通

HQ 450-490 nm

Q 495 (LP)

500-550 nm

Endow GFP 长通

HQ 450-490 nm

Q 495 (LP)

500 nm (LP)

TRITC (DsRed)

HQ 530-560 nm

Q 570 (LP)

590-650 nm

Yellow GFP 带通

HQ 490-510 nm

Q 515 (LP)

520-550 nm


    长时间高强度光照及紫外线照射将会对滤色片造成损害,另外,环境的湿度也会对滤片的带通造成影响。为了延长滤片的使用寿命,应该将滤片储存在干燥器中,或者放置在有干燥器的密封箱内。同时,应当减少滤片的曝光的时间,如不观察的时候应该关闭光源的光闸,保护滤片。清洁滤片时应使用洗耳球、驼毛刷,或无油的气体加压器通过干燥的空气进行清洁。千万不可以使用擦镜纸,它们会划伤滤片上的镀膜。

     以Nikon SMZ1500为例,这款体视镜的放大倍数为4x540x,接近一台复合式显微镜的放大倍数。研究者可以通过这样的体视镜观察大体积的活样品,或经荧光标记的薄切片。Figure4为三色荧光染色的小鼠肾脏切片。使用的染料分别为DAPI, Alexa Fluor 488 WGA, Alexa Fluor 568,相应的滤色片为Table1中的Blue GFP/DAPI, Endow GFP Bandpass, TRITC DsRed。这张图片体现了体视镜具备了观察复合式显微镜样品的能力。

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    其他显微镜制造商有着不同的提示荧光照明设计,如Figure5中为比较主流的模式之一。在这一设计中,有一个独立于成像光路的荧光照明通道。由光源发出的光首先经过激发光滤色片,然后通过主机后方的通道到达底部的透镜组,这些透镜组将光传导到样品上。这样的设计保证了无论在何种放大倍数下,激发光都会直接照射在样品上,范围,发射光强度,黑背景都不随放大倍数改变。发射出的荧光通过物镜到达变倍体后,透过发射光滤光片,进入目镜用于观察或进入相机。这一设计主要的优势在于取消了半透半反镜,并且滤片的组合可变,研究者可选的范围很大。然而,这也带来了相应的问题,如,没有经验的操作者可能会因为选择了错误滤片组合而观察不到荧光。

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    由汞灯产生的强紫外线会损伤观察者的视网膜。许多厂家为了避免这一事故都引用了保护设施滤掉照射在样品及载物台上的紫外线。同时还有很多其他的保护措施,如在光路中加入滤片。体视荧光镜中通常在灯箱及垂直照明器之间装有光闸,当不观察样品或不照相时,光闸将会关闭,以保护样品不受长时间紫外线的伤害。有时在高倍平场复消色差物镜(1.6x2.0x)配合低变倍比的情况下,视野里较低的部分可能会出现反射及hot spots现象。这一假象通常在调高变倍比时消失。而且在使用低放大倍数物镜(0.5x1.0x)以及高放大倍数低校正物镜(消色差物镜,平场消色差物镜)时不会出现这一假象。使用体视镜可以观察很多种样品,如Table2,从生物到工业制造。

    体视镜荧光的应用

领域

应用

生物学

基因表达,细胞分类,解剖,发育过程,眼及肌肉的研究

植物学

植物细胞,组织自发荧光,鼓励样品,寄生虫

药理学

毛细流动,药物,观察

水文学

水质,细胞结构,滤膜分析

农业经济学

种子观察,基因表达,转基因

电子学

焊膏,环氧树脂分析,显示器涂料,集成电路聚合物铸件

半导体

光阻污染,外来颗粒,加工错误

聚合物

外来颗粒,空隙,珠粒分析,非聚合区域

金属制造

裂缝及表面缺陷,污染,焊接控制,断口分析

材料

裂缝,焊接,碳键,断裂,定位研究

造纸

纤维包被及内含物

法医学

纺织纤维,体液,指纹,银行票据,赝品

    与复合式显微镜相比,大工作距离及景深使体视荧光能够提供全景信息并观察高强度荧光。这些特性为研究者们带来了很多便利,比如可以操作大的生物样品,或者材料技术师可在此进行包埋,检查电子元件,或切割。现在特殊用途的滤片组合越来越丰富,体视荧光镜也将得到更好的发展。

 


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