荧光显微镜的出现，让细胞器的观察成为可能，而如果要观察到更细致的目标，则需要做单分子荧光成像，今天我们就来分享一个今年用TIRF全内反射荧光显微镜做的单分子荧光成像研究：外泌体分泌动力学受温度控制。
·为什么使用TIRF全内反射荧光显微镜
全内反射荧光显微镜MF53-TIRF
TIRF全内反射荧光显微镜是利用光线全反射后形成衰逝波特性，来实现薄区域荧光观察的光学仪器，这种显微镜相比常规荧光显微镜（宽场荧光），背景荧光显著更低，可以实现信噪比更高、细节更丰富的荧光成像，尤其适合应用于细胞膜物质的动态观察。
衰逝波①
衰逝波是一种光学现象，当激发光以特定角度入射时，会发生全反射现象，所有激发光会被反射，靠近反射面的样品面则会形成一个深度仅几百纳米，光强呈指数衰减的激发光，称为衰逝波。
普通荧光成像与TIRF成像对比①
利用衰逝波，TIRF全内反射荧光显微镜可以将激发范围控制在样品面极薄的区域，从而避免了传统荧光显微镜焦面以外的荧光激发形成的模糊光晕，大大提升了信噪比和分辨率。由于衰逝波光强呈指数衰减，因此最合适的应用是细胞膜相关研究。
·外泌体分泌动力学受温度控制
我们来看一个论文案例，从中了解TIRF全内反射荧光显微镜的应用优势：超高分辨率、动态观察。
使用CD63-pHluorin可视化pH敏感蛋白
使用CD63-pHluorin可视化外泌体与质膜融合过程。TIRF全内反射荧光显微镜可以实现单分
子动态跟踪观察，为此需要配备高帧率、高灵敏度的显微镜相机，比如MSH12之类背照式sCMOS科学相机。
按成像分析，区分外泌体不同活动方式②
单分子荧光成像研究通常涉及数据统计分析等内容，往往需要一定的算法设计来自动化分析和量化处理，比如本论文使用的就是MATLAB脚本，在github可以下载。
成像分析可靠性验证，排除溶酶体或囊泡转运②
通过成像分析CD63-pHluorin可视化外泌体与质膜融合，排除溶酶体或囊泡转运。
外泌体与质膜融合有多种动力学模式②
算法分析，得出外泌体与质膜融合有多种动力学模式。
外泌体与质膜融合事件受温度控制②
对不同动力学模式进行分析，显示外泌体与质膜融合事件受温度控制。
模型验证②
利用模型验证解释实验观察到的动力学。
进一步的动力学分析②
外泌体与质膜融合前先有对接。
·结尾
总体而言，全内反射荧光显微镜MF53-TIRF是细胞表面物质动态观察的理想仪器，如固定在盖玻片或细胞膜表面上的分子等，在TIRF基础上明美还有dSTORM超分辨成像方案，有兴趣的老师可以跟我们联系。
如您对这篇论文感兴趣，或者有兴趣获取论文使用的MATLAB自动分析处理脚本，请参考应用来源部分信息②。
引用来源：
①Fish KN. Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. Curr Protoc. 2022 Aug;2(8):e517. doi: 10.1002/cpz1.517. PMID: 35972209; PMCID: PMC9522316.
②Mahmood A, et al. Exosome secretion kinetics are controlled by temperature. Biophys J. 2023 Apr 4;122(7):1301-1314. doi: 10.1016/j.bpj.2023.02.025. Epub 2023 Feb 22. PMID: 36814381; PMCID: PMC10111348.
